依鲁替尼(ibrutinib)、伊布替尼不发挥毒性作用-

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所属分类:疗效
摘要

为了测试依鲁替尼对神经炎症的影响,我们首先检测依鲁替尼是否对BV2小胶质细胞有毒性。BV2小胶质细胞用vehicle(1%DMSO)或依鲁替尼(100、250、

  依鲁替尼(ibrutinib)不发挥毒性作用,对BV2小胶质细胞的浓度达到25°M  

  为了测试依鲁替尼(ibrutinib)对神经炎症的影响,我们首先检测依鲁替尼(ibrutinib)是否对BV2小胶质细胞有毒性。BV2小胶质细胞用vehicle(
依鲁替尼(ibrutinib)、伊布替尼不发挥毒性作用-
1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)(100、250、500、750或1000nM)处置24小时,并进行MTT检查。依鲁替尼(ibrutinib)在低剂量时没有表现出毒性。我们还检测了高剂量的依鲁替尼(ibrutinib)对细胞活力的影响。为此,将BV2小胶质细胞用vehicle(1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)处置24小时,并进行MTT检查。我们发现,依鲁替尼(ibrutinib)在浓度达到25°M时不会诱导BV2小胶质细胞毒性。  

  确定依鲁替尼(ibrutinib)LPS-induced形态学的改变BV2小胶质细胞,细胞使用依鲁替尼(ibrutinib)(1μM)或车辆(1%DMSO)30分钟,接着用有限合伙人(1μg/ml)或PBS为5.5h。细胞被固定在4%多聚甲醛和应用anti-CD11b抗体。与经车载处置的细胞相比,经脂多糖处置的BV2小胶质细胞显示出长而细的突起,从胞体延伸依鲁替尼(ibrutinib)预处置后再进行LPS处置,降低了从细胞体延伸出的长而细的突起数量,这些细胞的形态类似于经溶剂处置的细胞。  

  依鲁替尼(ibrutinib)可显著减少脂多糖诱导的促炎细胞因子水平  

  调查潜在的监管依鲁替尼(ibrutinib)对促炎反应的影响,BV2小胶质细胞处置车辆(1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)30分钟(1μM),其次是有限合伙人(1μg/ml)或PBS为5.5h。总RNA分离,用rt-pcr和促炎细胞因子水平测定。与不加LPS的溶剂对照医治相比,单独使用依鲁替尼(ibrutinib)并没有改变任何促炎细胞因子水平。然而,依鲁替尼(ibrutinib)显著减少了脂多糖诱导的促炎细胞因子COX-2、IL-6、IL-1的蛋白转移扩散酶、iNOS和TNF--a的mRNA水平。作为一种替代方式,我们使用免疫细胞化学。在本实验中,BV2小胶质细胞区别用vehicle(1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)(1°M)处置30min,LPS(1°g/ml)或PBS处置5.5h,然后用抗cd11b和抗cox-2抗体进行免疫染色。依鲁替尼(ibrutinib)可显著减少脂多糖诱导的BV2小胶质细胞COX-2水平。为了进一步证实这些发现,我们进行了IL-1ELISA试验。为此,用依鲁替尼(ibrutinib)(500nM)或溶剂对照液(1%DMSO)预处置BV2小胶质细胞30分钟,用LPS(100ng/ml)或PBS处置24小时,并进行IL-1ELISA检查。与上述结果一致的是,与LPS处置相比,依鲁替尼(ibrutinib)显著减少了LPS诱导的IL-1蛋白的水平。这些结果表明,依鲁替尼(ibrutinib)预处置可调节脂多糖介导的BV2小胶质细胞促炎反应的延长。  

  然后我们研究了依鲁替尼(ibrutinib)医治后是否会改变脂多糖刺激的促炎反应。将BV2小胶质细胞用LPS(1磅/毫升)或PBS处置30分钟,然后用溶剂对照(1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)(1磅/毫升)处置5.5小时,分离总RNA,用RT-PCR检查促炎细胞因子水平。同样,与不使用LPS的载体医治相比,依鲁替尼(ibrutinib)本身并没有减少任何促炎细胞因子的水平。然而,依鲁替尼(ibrutinib)医治后显著减少了脂多糖诱导的COX-2、IL-6和iNOS的mRNA水平,但不减少其他促炎细胞因子的mRNA水平。因此,这些数据表明,依鲁替尼(ibrutinib)预处置(作为一种预先防范措施)或医治后(作为一种医治措施)对脂多糖刺激的BV2小胶质细胞的促炎反应有差异。  

  依鲁替尼(ibrutinib)抑制脂多糖刺激的原发性小胶质细胞促炎细胞因子水平的延长  

  为了确定依鲁替尼(ibrutinib)是否能调节LPS诱导的原代胶质细胞的促炎反应,我们将原代小胶质细胞区别用vehicle(1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)(1,M)处置30分钟,然后用LPS(1,l,g/ml)或PBS处置5.5小时。然后用RT-PCR检查促炎细胞因子水平。LPS医治显著上调了促炎细胞因子的水平。相比之下,依鲁替尼(ibrutinib)显著下调了脂多糖介导的原代小胶质细胞中编码促炎细胞因子COX-2和IL-6的mrna水平的上升。  

  然后我们研究了依鲁替尼(ibrutinib)是否也影响脂多糖刺激的原代星形胶质细胞促炎细胞因子水平。将原代星形胶质细胞用溶剂对照液(1%DMSO)或依鲁替尼(ibrutinib)(1,1,M)处置30分钟,用LPS(1,1,g/ml)或PBS处置5.5小时,然后用RT-PCR检查促炎细胞因子水平。令人惊讶的是,依鲁替尼(ibrutinib)并没有减少脂多糖诱导的原始星形胶质细胞中任何促炎细胞因子的水平。这些数据表明依鲁替尼(ibrutinib)选择性地影响促炎反应取决于细胞类别。  

  依鲁替尼(ibrutinib)通过调节TLR4改变脂多糖诱导的促炎细胞因子水平  

  LPS与小胶质细胞表面的TLR4互相作用,延长免疫应答。因此,我们推测依鲁替尼(ibrutinib)可能抑制细胞表面LPS和TLR4的互相作用和/或TLR4的激活,从而调节神经炎症反应。为了测试这个假说,BV2小胶质细胞使用tak-242(TLR抑制剂,500海里)或车辆(1%DMSO)30分钟,接着用依鲁替尼(ibrutinib)(1μM)或车辆(1%DMSO)30分钟和后续医治与有限合伙人(1μg/ml)或PBS5h。总RNA是孤立的,和il-1β和cox-2mRNA水平通过rt-pcr检查。与我们的研究结果一致,依鲁替尼(ibrutinib)显著减少脂多糖诱导的COX-2和IL-1mRNA水平。此外,与LPS、takc-242或依鲁替尼(ibrutinib)和LPS处置相比,takps-242、依鲁替尼(ibrutinib)和LPS处置进一步减少了LPS诱导的COX-2mRNA水平。然而,与LPS和takc-242或依鲁替尼(ibrutinib)和LPS相比,takps-242、依鲁替尼(ibrutinib)和LPS处置并没有显著减少LPS诱导的IL-1mRNA水平。  

  DMSO)处置30分钟,然后用LPS(1°bg/ml)或PBS处置5.5小时,并进行细胞表面生物素化。我们发现,LPS处置显著延长了细胞表面的TLR4水平。然而,与LPS处置相比,依鲁替尼(ibrutinib)减少了LPS诱导的细胞表面TLR4水平,但并未改变TLR4的总水平。这些数据表明依鲁替尼(ibrutinib)可能调节细胞表面TLR4水平,并可能抑制细胞表面TLR4和LPS之间的互相作用,从而改变LPS刺激的促炎反应。  

  依鲁替尼(ibrutinib)改变AKT讯号通路以调节脂多糖诱导的促炎反应  

  根据最近的一些研究,MAP激酶讯号通路(如ERK、JNK、p-P38、AKT)在调节胶质细胞促炎细胞因子水平中发挥重要作用。因此,我们研究了依鲁替尼(ibrutinib)是否下调或上调lps诱导的MAP激酶讯号。BV2小胶质细胞区别用依鲁替尼(ibrutinib)(1°M)或vehicle(1%DMSO)预处置1小时,然后用LPS(1°g/ml)或PBS处置45分钟,用anti-p-ERK/ERK、anti-p-JNK/JNK或anti-p-P38/P38抗体进行westernblotting检查。出乎意料的是,依鲁替尼(ibrutinib)并没有降低lps介导的BV2小胶质细胞中p-ERK水平的上升。同样,我们观察到依鲁替尼(ibrutinib)并没有抑制lps诱导的BV2小胶质细胞中p-JNK和p-P38的水平。  

  然后我们研究了依鲁替尼(ibrutinib)是否改变了脂多糖诱导的p-AKT讯号通路。为了验证这一点,将BV2小胶质细胞用依鲁替尼(ibrutinib)(1°M)或vehicle(1%DMSO)处置1小时,然后用LPS(1°g/ml)或PBS处置45分钟,用抗p-akt和抗akt抗体进行westernblot。我们发现,依鲁替尼(ibrutinib)可显著减少脂多糖诱导的BV2小胶质细胞中p-AKT水平的上升。  

  接下来,我们研究了更长时间内依鲁替尼(ibrutinib)(伊布替尼)对lps诱导的p-AKT水平的影响。BV2小胶质细胞区别用依鲁替尼(ibrutinib)(1°M)或vehicle(1%DMSO)预处置5小时,然后用LPS(1°g/ml)或PBS处置45分钟,用抗p-akt和抗akt抗体进行westernblotting检查。与LPS处置相比,更长时间的依鲁替尼(ibrutinib)处置显著减少了LPS介导的p-AKT水平的上升。此外,我们测量了依鲁替尼(ibrutinib)(伊布替尼)本身是否在没有LPS的情况下影响AKT的磷酸化。在本实验中,用依鲁替尼(ibrutinib)(1×2M)或vehicle(1%DMSO)处置BV2小胶质细胞6小时,用抗p-akt和抗akt抗体进行westernblot。出乎意料的是,单独依鲁替尼(ibrutinib)可显著减少BV2小胶质细胞的p-AKT水平,但总AKT水平没有变化。  

  测试是否依鲁替尼(ibrutinib)调节一种蛋白激酶讯号改变LPS-mediated促炎反应,BV2小胶质细胞与MK2206预处置(AKT抑制剂,10μM)或车辆(1%DMSO)30分钟,对待依鲁替尼(ibrutinib)(1μM)或车辆(1%DMSO)30分钟,处置有限合伙人(1μg/ml)或PBS5h,cox-2和mRNA水平和il-1β通过rt-pcr检查。与使用依鲁替尼(ibrutinib)和LPS或使用MK2206和LPS相比,使用MK2206、依鲁替尼(ibrutinib)和LPS显著抑制IL-1蛋白的mRNA水平。相比之下,与使用依鲁替尼(ibrutinib)和LPS或使用MK2206和LPS相比,使用MK2206、依鲁替尼(ibrutinib)和LPS并没有显著减少COX-2的mRNA水平。这些数据表明,依鲁替尼(ibrutinib)对脂多糖诱导的BV2小胶质细胞促炎反应的作用部分依赖于AKT讯号通路。老挝东盟的依鲁替尼(ibrutinib)价钱怎么样呢?详情请扫码咨询:

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